Umieszczenie tularemii w grupie nowo pojawiających się zoonoz zagrażających zdrowiu publicznemu (emerging zoonoses of public health concern) ponownie zwróciło uwagę na chorobotwórczość Francisella tularensis (F. tularensis) dla zwierząt i człowieka, a zwłaszcza na możliwość użycia tego zarazka jako jednej z najgroźniejszych broni biologicznych. Ze względu na wysoką zaraźliwość F. tularensis zaliczana jest do kategorii A – czynników biologicznych najwyższego ryzyka. Widmo zakaźne F. tularensis jest bardzo szerokie, bo obejmuje około 190 gatunków ssaków, 23 gatunki ptaków oraz 3 gatunki płazów i ryby. U zwierząt z gatunków najbardziej podatnych na chorobę tularemia przebiega najczęściej w formie ostrej posocznicy i kończy się zejściem śmiertelnym. Postać podostra choroby charakteryzuje się powstawaniem w śledzionie, wątrobie, a szczególnie węzłach chłonnych ropni oraz postępującym wyniszczeniem. Jawna postać choroby występuje głównie u zajęczaków i gryzoni oraz człowieka. U zwierząt mniej wrażliwych tularemia ma łagodny przebieg. Tularemia jest klasyczną zoonozą. W warunkach naturalnych ludzie narażeni są na zakażenie szczególnie przy ubijaniu chorych królików, ich skórowaniu oraz dzieleniu tuszki bądź też na skutek ukąszeń spowodowanych przez bąki, komary i kleszcze. Prawdopodobnie zakażenie F. tularensis następuje także drogą kropelkową oraz pokarmową w wyniku zjedzenia niedogotowanego mięsa lub wypicia wody zanieczyszczonej tą bakterią. W zależności od miejsca wnikania zarazka do organizmu tularemia u ludzi może przebiegać w kilku postaciach. Tularemia należy w Polsce do chorób zakaźnych zwierząt podlegających obowiązkowi rejestracji.

Epidemiologia

Tularemia występuje na półkuli północnej. Najliczniejsze zachorowania notowano na terenach byłego ZSRR, w Turcji, byłej Jugosławii, Hiszpanii, Republice Czeskiej, Słowacji i krajach skandynawskich. Występują one także w USA, Kanadzie, Meksyku i Azji. Natomiast w Polsce ogniska tularemii notowano sporadycznie w województwach północno-zachodnich i północno-wschodnich. W ogniskach endemicznego występowania tularemii w surowicy zwierząt wolno żyjących stwierdza się obecność przeciwciał skierowanych przeciwko F. tularensis. Tularemia pojawia się zwykle w okresie jesienno-zimowym, co jest związane z nastaniem chłodów i wędrówką gryzoni do pomieszczeń hodowlanych. Chorują nutrie, szczury, myszy, chomiki, wiewiórki, piżmaki i susły. Tularemię stwierdzono również u małp, lisów, niedźwiedzi, wilków, łasic, jenotów, kretów, sów, sępów, myszołowów, przepiórek, kuropatw, wróbli, wron, ryb i żab, a także zajęcy. W Europie tularemia notowana jest głównie u zająca brązowego (szaraka) (Lepus europaeus) oraz u zająca górskiego (Lepus timidus), a ponadto u zająca japońskiego (Lepus brachyurus). Natomiast zwiększoną oporność naturalną na zakażenie Francisella tularensis wykazuje europejski dziki królik (Oryctolagus cuniculus). Z kolei na innych kontynentach największą podatność na chorobę wykazują króliki z rodzaju Sylvilagus spp. i królik kalifornijski (Lepus californicus) oraz zając amerykański (Lepus americanus). Ze zwierząt domowych chorują owce (jagnięta), kozy, konie, bydło, świnie, psy, koty oraz kury.

Właściwości biologiczne czynnika etiologicznego

Ryc. 1. Tularemia pojawia się zwykle w okresie jesienno-zimowym, co jest związane z nastaniem chłodów i wędrówką gryzoni do pomieszczeń hodowlanych.

Przyczyną choroby jest mała, pleomorficzna, bezrzęskowa, tlenowa, Gram-ujemna ziarniako-pałeczka Francisella tularensis o wymiarach 0,2-0,5 µm do 0,7-1,7 µm, barwiąca się dwubiegunowo, niewykazująca ruchu i niewytwarzająca przetrwalników. Na podłożach stałych po 4-dniowej inkubacji pojawiają się szarobiałe kolonie wielkości 1 mm. W ujęciu najnowszej systematyki Bergeya do rodziny Francisellaceae należy rodzaj Francisella, obejmujący dwa odrębne gatunki, tj. F. tularensis i F. philomiragia, wyodrębnione na podstawie analizy sekwencji 16S rDNA. Dodatkowo w obrębie gatunku F. tularensis wyodrębniono cztery podgatunki, tj. F. tularensis subsp. tularensis, F. tularensis subsp. palaearctica, F. tularensis subsp. mediasiatica i F. tularensis subsp. novicida (21, 23).

Na podstawie właściwości biochemicznych i zjadliwości dla królików w obrębie szczepów F. tularensis wyróżniono początkowo dwa typy zarazka, z których pierwszy stanowiła F. tularensis subsp. tularensis (typ A lub podgatunek nearctica), drugi typ zaś F. tularensis subsp. palaearctica (typ B lub podgatunek holarctica). Oba typy zarazka są jednolite pod względem antygenowym, natomiast różnią się właściwościami biochemicznymi i zasięgiem geograficznym. Różnicowanie tych szczepów jest możliwe poprzez analizę sekwencji RNA (analiza 16S rRNA). Typ A o wysokiej zjadliwości, do którego należy F. tularensis subsp. tularensis, zwykle występuje na obszarze Ameryki Północnej, gdzie izolowany jest głównie od królików i kleszczy. Ostatnio typ A notowany jest także w Europie (9). U człowieka szczepy należące do typu A wywołują postacie płucną i trzewną (durową) choroby. Z kolei typ B, do którego należy F. tularensis subsp. palaearctica, jest mniej zjadliwy dla królików i bardziej rozpowszechniony w środowisku. Występuje w Europie i Azji, rzadziej w Ameryce Północnej. Olsufjev i Mesheryakova (22) w obrębie podgatunku F. tularensis subsp. palaearctica wyróżniają dodatkowo trzy odmiany: I – wrażliwa na erytromycynę, II – oporna na erytromycynę, i III – odmiana japońska. Natomiast F. tularensis subsp. novicida charakteryzuje się niższą zjadliwością dla ludzi i nie ma otoczki, która jest jednym z czynników determinujących właściwości chorobotwórcze zarazka.

Według bazy danych NCBI (National Center of Biotechnology Information) wielkość genomu F. tularensis subsp. holarctica (szczep FSC200) wynosi 1 790 358 bp, a F. tularensis subsp. novicida (szczep U112) – 1 910 031 bp. Na szczególną uwagę zasługuje obecność w genomie F. tularensis elementów IS (insertion sequence) podzielonych na 5 grup: ISFtu1 (rodzina IS630), ISFtu2 (rodzina IS5), ISFtu3 (rodzina ISHpal-IS1016), ISFtu4 (rodzina IS982), ISFtu5 (rodzina IS4). Larsson i wsp. (16) w genomie F. tularensis zidentyfikowali 50 kopii zlokalizowanych w transpozonach sekwencji należących do rodziny IS 630 Tc-1 (mariner-like elements, MLEs). Element insercyjny ISFTu1 spełnia kluczową rolę w ekspresji antygenu O będącego jednym z zasadniczych determinantów wirulencji tej bakterii. Francisella tularensis ma jedno regulatorowe białko Mg1A odpowiedzialne za przebieg procesu transkrypcji oraz za ekspresję genów iglC, igLa, pdpA, pdpD zaliczanych do regionu FPI. Wiadomo, że mutacje genów iglA, iglC lub pdpD powodują redukcję zdolności bakterii F. tularensis do przeżywania w amebach i makrofagach. Nie jest jednak dokładnie poznana ich funkcja, choć dokonano lokalizacji wymienionego regionu w 33,9 kb chromosomu bakteryjnego. Larsson i wsp. (16) identyfikowali geny kodujące białka fosfolipazy C acpA (FTT0221) i fosfolipazy D (FTT0490), które mogą pełnić rolę w procesie degradowania przez F. tularensis błony fagosomów i ich wnikania do cytozolu makrofaga.

Jednym ze szczepów szczególnie ważnych pod względem wirulencji jest szczep F. tularensis subsp. tularensis SCHU S4, co wiąże się z obecnością w jego genomie rejonu IS-Ftu1, pierwotnie zidentyfikowanego u bakterii Shigella sonnei. Genom szczepu SCHU S4 ma wielkość 1 892 819 bp i zawiera 1804 sekwencje kodujące CDS (ang. coding sequences), z których 302 są konserwatywne dla rodzaju Francisella. Nie ma on plazmidu pOM1 lub pNFL10, a udział zasad G i C stanowi 32,9% całości zasad purynowych i pirymidynowych w genomie i mieści się w zakresie 20-40%, który obserwowany jest w małych genomach bakteryjnych (16). Genom szczepu SCHU S4 odznacza się wysokim udziałem sekwencji kodujących na poziomie 79,4%. W genomie szczepu SCHU S4, oprócz 302 genów konserwatywnych dla rodzaju Francisella, zidentyfikowano również 201 pseudogenów lub fragmentów genów. Genofor szczepu SCHU S4 charakteryzuje się dużym udziałem genów nieaktywnych. W wyniku mutacji punktowych, czyli insercji, delecji i substytucji, około 10% genów staje się pseudogenami lub genami sfragmentaryzowanymi, z której to puli około 14% to miejsca insercji rejonów IS-Ftu 1-5. Zawiera on także wysoki odsetek genów o cechach genów metabolizmu podstawowego, których uszkodzenie powoduje zaburzenie szlaków metabolicznych związanych z zakresem wymagań środowiskowych, a tym samym warunkami wzrostu i podziałów komórkowych. Ocenia się, że genom szczepu SCHU S4 zawiera 25 genów będących homologami sekwencji kodujących mogących determinować cechy wirulencji. Ponieważ uszkodzenie genomu bakteryjnego w regionie genów odpowiadających za zjadliwość powoduje powstawanie mutacji wyrażających się osłabioną ich przeżywalnością w makrofagach, wymieniony region genoforu bakteryjnego określany jest jako FPI (ang. Francisella pathogenicity island). Larsson i wsp. (16) sklasyfikowali białka kodowane przez sekwencje CDS szczepu SCHU S4, przynależne do 61 różnych grup. Największa grupa zawiera 5 białek: FTT0025, FTT0267, FTT0602, FTT0918 oraz FTT0919. Należy podkreślić, że białka FTT0025, FTT0918 i FTT0919 zawierają jednocześnie peptydy sygnałowe oraz domeny o strukturze spiralnej, w odróżnieniu od białka FTT0267, zawierającego tylko peptydy sygnałowe, i FTT0602, charakteryzującego się obecnością domen spiralnie skręconych.

Francisella tularensis rośnie w warunkach tlenowych na podłożach o pH 6,9, wzbogaconych w cystynę lub cysteinę. Do izolacji zarazka jest stosowane podłoże Francisa, agar z krwią z dodatkiem glukozy i cysteiny, agar cysteinowy wzbogacony 9% dodatkiem erytrocytów baranich, Cystine Hart Agar z dodatkiem hemoglobiny i Thayer-Martin Agar z odpowiednim suplementem. Na tych podłożach wzrost bakterii jest widoczny po mniej więcej 18 godzinach, a w przypadku niektórych szczepów dopiero po 3-6-, a nawet 10-dniowej inkubacji. Francisella tularensis rośnie powoli w temperaturze 37°C i bardzo słabo w 28°C, co wykorzystuje się przy różnicowaniu F. tularensis od F. tularensis subsp. novicida i F. philomiragia, które dobrze rosną w 28°C. Na podłożach stałych wzrost bakterii jest widoczny w postaci gładkich, nieznacznie śluzowatych kolonii o wielkości 2-4 mm i barwie zielonkawobiałej. Ponadto na podłożach krwawych tworzy dodatkowo małą strefę hemolizy, na podłożu Francisa zaś może rosnąć w formie rozlanych kolonii o mlecznym zabarwieniu. Francisella tularensis produkuje siarkowodór i jest oksydazoujemna. Natomiast występują pewne różnice pomiędzy poszczególnymi podgatunkami w zakresie zdolności fermentacji cukrów. Francisella tularensis subsp. tularensis fermentuje glicerol i maltozę, F. tularensis subsp. novicida sacharozę i glicerol, natomiast F. tularensis subsp. holarctica tylko maltozę (10).

Ryc. 2. W Europie tularemia notowana jest głównie u zająca brązowego (szaraka) (Lepus europaeus).

Francisella tularensis jest dość oporna na czynniki środowiska zewnętrznego oraz wrażliwa na powszechnie stosowane środki odkażające. W wyschniętym sianie i słomie może przeżywać około 120 dni, na ziarnie roślin trawiastych do 133 dni i do 3 miesięcy w wodzie, glebie oraz zwłokach zwierząt. W wysuszonych skórach przeżywa do 45 dni, w hemolimfie kleszczy i owadów do 240 dni, w tuszkach zajęcy do 133 dni. Natomiast w zamrożonym mięsie króliczym zarazek zachowuje swoją żywotność przez wiele lat. W próbkach zabezpieczonych glicerolem F. tularensis zachowuje żywotność i zjadliwość przez miesiąc w temperaturze pokojowej, 6 miesięcy w -10°C i 8-12 miesięcy w temperaturze -13°C. W wodzie przy temperaturze 13-15°C zarazek zachowuje żywotność przez 3 miesiące. Natomiast w temperaturze 56-58°C ulega on inaktywacji w ciągu 10 minut, pod wpływem promieni słonecznych po 30 minutach, natomiast światło rozproszone zabija zarazek w ciągu 3 dni. Francisella tularensis jest wrażliwa na tetracykliny, chloramfenikol, aminoglikozydy (streptomycyna, gentamycyna), ryfampicynę, tobramycynę, kanamycynę, chinolony (cyprofloksacynę, lewofloksacynę, grepafloksacynę, trowafloksacynę). Natomiast większość szczepów jest oporna na antybiotyki β-laktamowe, makrolidy (erytromycynę, roksytromycynę, klarytromycynę i azytromycynę) (11).

Źródła zakażenia i drogi szerzenia się choroby

Zasadnicze źródło zakażenia stanowią chore gryzonie i zajęczaki lub nosiciele, którzy okresowo wydalają zarazek wraz z wydalinami i wydzielinami. W tym przypadku zakażenie następuje przez kontakt bezpośredni zwierzęcia zakażonego ze zdrowym. Wrota zakażenia stanowi nieuszkodzona skóra (mieszki włosowe i przewody wyprowadzające gruczołów łojowych), układ oddechowy, przewód pokarmowy oraz spojówki. Zakażenie szerzy się także za pośrednictwem zanieczyszczonego środowiska, pokarmu i wody. Istotną rolę odgrywają również wektory ożywione, takie jak muchy, komary, pchły, ślepaki, bąki, bolimuszki, jusznice oraz kleszcze i roztocze. W Europie główną rolę odgrywają kleszcze z gatunku Dermacentor reticulatus i Ixodes ricinus, które pełnią rolę biologicznych przenosicieli F. tularensis, a ponadto u wielu gatunków zarazek jest przekazywany transowarialnie nowemu pokoleniu. W warunkach naturalnych rezerwuarem F. tularensis są m.in. wiewiórki ziemne, króliki, zające, myszowate, szczury piżmowe, szczury wodne, nornice i inne gryzonie zanieczyszczające produkty stanowiące pokarm dla ludzi i zwierząt oraz ściółkę.

Patogeneza

Patogeneza tularemii zajęczaków jest słabo poznana. Francisella tularensis jest bezwzględnym patogenem wewnątrzkomórkowym, wykazującym szczególny tropizm do makrofagów. Po sfagocytowaniu bakterii i utworzeniu fagosomu nie dochodzi do fuzji z lizosomami i tworzenia fagolizosomu, co umożliwia namnażanie się i przeżycie F. tularensis w cytozolu komórki zakażonej. W czasie przebywania wewnątrz zakażonych makrofagów bakterie degradują błonę fagosomu i przedostają się do cytozolu. Zakażona komórka ulega apoptozie. Efektem tego jest uwolnienie bakterii i zakażanie kolejnych komórek gospodarza, co prowadzi do stopniowego rozprzestrzeniania się zakażenia w organizmie (2, 4, 15).

Czynnikiem zjadliwości F. tularensis jest cytochalazyna B, hamująca reakcję wybuchu tlenowego (RB – respiratory burst) w zakażonych makrofagach, której końcowym efektem jest tworzenie reaktywnych form tlenu o działaniu bakteriobójczym. Kolejnym czynnikiem zjadliwości F. tularensis jest otoczka chroniąca przed litycznym działaniem białek układu dopełniacza. Silne właściwości immunosupresyjne antygenów otoczkowych hamują także odpowiedź immunologiczną gospodarza. Istotną rolę w patogenezie tularemii stanowi endotoksyna (LPS – lipopolisacharyd), która modulując nieswoistą odporność organizmu poprzez brak stymulacji syntezy IL-1 oraz wpływ na zdolność syntezy NO (tlenek azotu) przez komórki gospodarza, ułatwia intensywny wzrost F. tularensis w makrofagach.

Proces rozwoju choroby przebiega podobnie u wszystkich gatunków zwierząt oraz człowieka. Istnieją natomiast różnice gatunkowej wrażliwości na zakażenie, co wyraża się stopniem nasilenia objawów. U zwierząt najbardziej podatnych na zakażenie rozwija się groźna posocznica i w ciągu 1-3 dni następuje zejście śmiertelne. Natomiast u zwierząt mniej wrażliwych choroba przebiega w postaci łagodnej, co jest spowodowane znacznym ograniczaniem namnażania się zarazka w narządach wewnętrznych.

W miejscu wniknięcia pałeczek tularemii w błonie śluzowej jamy ustnej lub na skórze powstaje silnie zaznaczony pierwotny odczyn zapalny w postaci grudki, która poprzez szereg następnych faz przechodzi w owrzodzenie. Pałeczki tularemii wykazują limfotropizm, stąd też z bramy wejścia zarazek przedostaje się do naczyń chłonnych i kolonizuje najbliższe węzły chłonne, gdzie po dalszym intensywnym namnożeniu się wywołuje rozwój charakterystycznego swoistego guza tularemicznego, zwanego dymienicznym. Proces chorobowy ograniczony jedynie do zmian w okolicznych węzłach chłonnych nosi miano zespołu pierwotnego. W tej formie proces chorobowy ma charakter zapalenia wytwórczego, a gruzełki nie ulegają martwicy. W momencie przełamania odporności zwierzęcia dochodzi do rozwoju bakteriemii, a następnie posocznicy. Wraz z zakażonymi makrofagami drogą krwionośną F. tularensis osiąga układ siateczkowo-śródbłonkowy, który jest jej miejscem docelowego działania. W następstwie posocznicy rozwija się uogólniony proces chorobowy z zajęciem narządów wewnętrznych, szczególnie płuc, opłucnej, śledziony, wątroby i nerek. Po namnożeniu się F. tularensis w makrofagu ulega on apoptozie, a uwolnione bakterie zakażają nowe komórki. W wyniku zakażenia dochodzi do rozwoju ostrego stanu zapalnego, czego skutkiem jest początkowo miejscowa martwica z naciekiem złożonym z neutrofilów, makrofagów, komórek nabłonkowych i limfocytów, w późniejszej fazie zaś tworzą się ziarniniaki.