Tularemia zajęczaków – aktualny stan wiedzy

Francisella tularensis, namnażając się w makrofagach, z jednej strony przyczynia się do uogólnienia procesu chorobowego, z drugiej zaś w wyniku rozwijającej się infekcji uruchamia wiele mechanizmów obronnych.

Objawy kliniczne

Okres inkubacji choroby wynosi najczęściej 3 dni. U królików choroba ma przeważnie przebieg ostry posocznicowy i kończy się po 1-3 dniach zejściem śmiertelnym. W przebiegu tej postaci początkowo obserwuje się nieznaczny wzrost temperatury ciała, osowiałość, osłabienie oraz spadek łaknienia. Następnie pojawia się nieżytowe zapalenie błony śluzowej nosa, znaczne powiększenie węzłów chłonnych, przyspieszenie oddechów i tętna oraz narastającą duszność. Ze względu na dużą bolesność i obrzęk okolicy pach oraz pachwin chore zwierzęta garbią się i wykazują sztywny, ostrożny i leniwy chód. Zające łatwo dają się złapać. Zejście procesu chorobowego zależy od zjadliwości szczepu oraz odporności zwierząt. Zakażenie szczepami słabo zjadliwymi przebiega łagodnie i ogranicza się jedynie do rozwoju zespołu pierwotnego w okolicznych węzłach chłonnych. Natomiast w przypadku zakażenia szczepami wysoko zjadliwymi proces chorobowy przechodzi w posocznicę i po 1-3 dniach następuje zejście śmiertelne. U zwierząt, które przeżyły, istnieje możliwość wystąpienia reinfekcji po 6-8 miesiącach od wyzdrowienia (7, 8, 29).

Rzadziej natomiast występuje postać podostra choroby, która charakteryzuje się powstawaniem w śledzionie, wątrobie, a szczególnie węzłach chłonnych ziarniniaków oraz postępującym wyniszczeniem organizmu. Zwierzęta tracą apetyt, pojawia się biegunka oraz niedokrwistość. Błony śluzowe są blade, natomiast węzły chłonne powiększone. Temperatura ciała jest podwyższona. Ta postać choroby może trwać dość długo (3, 18, 20).

Zmiany anatomo- i histopatologiczne

Ryc. 3. Tularemia jest klasyczną zoonozą i podlega w Polsce obowiązkowi rejestracji – zasadnicze źródło zakażenia stanowią chore gryzonie i zajęczaki lub nosiciele, którzy okresowo wydalają zarazek wraz z wydalinami i wydzielinami.

Badaniem sekcyjnym u królików w miejscu wniknięcia zarazka stwierdza się owrzodzenia i martwicę skóry. Węzły chłonne są powiększone, suche i wypełnione serowatą masą, którą łatwo daje się wyłuszczyć. Na ich powierzchni stwierdza się obecność guzków koloru szarobiałego. Śledziona, wątroba i nerki są silnie powiększone i zawierają prosówkowe lub większe szarobiałe ogniska martwicowe. Rozsiane guzki martwicze mogą występować także w płucach i na opłucnej.

Z kolei u zajęcy zmiany anatomopatologiczne różnią się w zależności od gatunku. U europejskiego zająca brązowego (Lepus europaeus) zmiany sekcyjne są opisane jako przewlekła ziarniniakowatość (ang. chronic granulomas) z martwicą zlokalizowaną zwłaszcza w płucach i nerkach (14, 19, 27). Zmiany martwicowe w postaci białych, szarobiałych lub żółtawobiałych okrągłych guzków o średnicy od 0,1 do 1,0 cm, wyraźnie odgraniczonych i otoczonych wałem przekrwienia, mogą być zlokalizowane w pojedynczych lub w wielu narządach wewnętrznych. Zmiany te stwierdza się najczęściej w płucach, wątrobie, nerkach, osierdziu i jądrach, rzadziej zaś w szpiku kostnym, gruczole mlekowym, śledzionie. Ogniska martwicy obecne na opłucnej, nerkach i osierdziu mają powierzchnię wypukłą, suchą i ziarnistą. Z kolei jądra są powiększone, a na ich przekroju widoczne są żółtawobiałe ogniska martwicy lub guzki. Niekiedy pojedyncze ogniska martwicy stwierdza się w szpiku kostnym i gruczole mlekowym. Płuca, nerki, wątroba i śledziona są obrzękłe, a ponadto na płucach są widoczne punkcikowate wybroczyny oraz duża liczba szarobiałych lub żółtobiałych ognisk martwiczych zlokalizowanych także w osierdziu i jądrach. Natomiast u zająca japońskiego (Lepus brachyurus) najczęściej stwierdza się obecność różnej wielkości ognisk martwiczych w śledzionie, szyjnych węzłach chłonnych i wątrobie (29).

W preparatach histopatologicznych u europejskiego zająca brązowego dominują zmiany martwicowe, cechujące się rozpadem jąder komórkowych, charakterystyczne dla zapalenia ziarniniakowatego. Zmiany zlokalizowane są najczęściej w płucach, osierdziu i nerkach, w przeciwieństwie do gryzoni i innych zajęczaków, u których lokalizują się one najczęściej w wątrobie oraz śledzionie. W ognisku zapalnym na obwodzie dominują makrofagi, a ponadto stwierdza się obecność limfocytów, granulocytów, wielojądrzastych komórek gigantycznych i fibrocytów, w centrum zaś obserwuje się martwicę. Zmiany martwicowe o charakterze zapalenia ziarniniakowatego można stwierdzić także w węzłach chłonnych śródpiersiowych, wątrobie, śledzionie i szpiku kostnym, mimo braku widocznych makroskopowo zmian anatomopatologicznych. Ponadto w obrazie histopatologicznym stwierdza się obrzęk pęcherzyków płucnych, obecność wysięku zapalnego wraz z resztkami komórek w oskrzelikach oraz ogniska martwicy w osierdziu. Liczne ogniska zapalenia ziarniniakowatego są także zlokalizowane w warstwie korowej i rdzeniowej nerek. Kanaliki nerkowe w obszarze zapalenia są wypełnione resztkami martwych komórek. Pod nabłonkiem miedniczki nerkowej stwierdza się wieloogniskowe zapalenie ziarniniakowate. W cewkach nasiennych jąder oraz najądrzy występują ogniska martwicy z obecnością wysięku zapalnego wypełniającego ich światło (29).

Natomiast u zająca japońskiego (Lepus brachyurus) w preparatach histopatologicznych dominują zmiany wieloogniskowej martwicy zlokalizowanej głównie wątrobie, śledzionie, śródpiersiowych węzłach chłonnych, płucach, nadnerczach, śródmózgowiu i korze mózgu oraz w szpiku kostnym, cechującej się rozpadem jąder komórkowych (7, 8, 29).

Rozpoznanie

Wstępne rozpoznanie choroby opiera się na danych z wywiadu, sytuacji epidemiologicznej, objawach klinicznych choroby i zmianach sekcyjnych. Objawy kliniczne w przebiegu tularemii królików są mało charakterystyczne. Ostateczne rozpoznanie choroby opiera się na uzyskanych wynikach badań mikroskopowych materiału pobranego z chorobowo zmienionych narządów, izolacji i identyfikacji zarazka, badaniach serologicznych oraz próbie alergicznej i biologicznej (4). Materiał do badań bakteriologicznych stanowi krew, płyn mózgowo-rdzeniowy i ropa z zamkniętych ropni skórnych lub węzłów chłonnych. Podczas wykonywania badań w kierunku tularemii należy zachowywać szczególną ostrożność ze względu na wybitną zakaźność i zaraźliwość zarazka. W rozpoznaniu tularemii pomocna jest również próba biologiczna, którą wykonuje się na świnkach morskich lub białych myszach. Zwierzęta te zakaża się śródskórnie lub dootrzewnowo zawiesiną badanego materiału. W przypadku dodatniej próby zejście śmiertelne następuje po 5-8 dniach od zakażenia. Następnie dokonuje się izolacji bakterii z materiału pobranego ze śledziony i węzłów chłonnych padłych zwierząt (7, 8, 29).

W diagnostyce tularemii stosowane są również metody pośrednie. Przeciwciała aglutynujące F. tularensis pojawiają się po 7 dniach i osiągają maksymalne miana po dwóch tygodniach od zakażenia. Wykazują one w badaniach serologicznych reakcje krzyżowe z bakteriami z rodzajów Brucella, Proteus, Yersinia i Legionella i dlatego też istnieje możliwość otrzymania wyników fałszywie dodatnich. Ponadto metody serologiczne mają ograniczoną przydatność z uwagi na fakt, że zejście śmiertelne u zajęczaków następuje zwykle jeszcze przed rozwojem odpowiedzi humoralnej (29).

Zgodnie z obecnymi standardami lekarsko-weterynaryjnymi w diagnostyce tularemii stosowane są techniki biologii molekularnej, które dają możliwość szybkiego i wiarygodnego wykrywania obecności bakterii F. tularensis i ich różnicowania ze względu na otrzymywanie wysoce swoistych produktów amplifikacji genomowego DNA zarazka. Jak podaje Junhui i wsp. (13), reakcja PCR jest przydatna do wykrywania bakterii F. tularensis we krwi, wątrobie i śledzionie, stanowiąc tym samym narzędzie potwierdzające podejrzenie kliniczne. W reakcji łańcuchowej polimerazy zastosowali startery w trzech kombinacjach (P₁-P₂, P₂-P₃ i P₁-P₄), przy czym ich sekwencje były następujące: 5’ TGG CGA GTC ATA CTG CTT G 3’ (starter P₁), 5’ TAG GAT CCC ATT AGC TGT CCA CTT ACC 3’ (starter P₂), 5’ GGA ATT CGT TAG GTG GCT CTG ATG AT 3’ (starter P₃) oraz 5’ CGC TAA ACC TGC GAT TGA T 3’ (starter P₄). Produkty amplifikacji o długościach 211 bp, 347 bp i 568 bp analizowano z użyciem restryktaz Taq1 i HindIII. Stwierdzono, że produkty PCR są wykrywalne już w 1 cfu (ang. colony forming unit) bakterii F. tularensis na ml próby. Long i wsp. (17) amplifikowali materiał genetyczny bakterii izolowanych z krwi z użyciem starterów FT393 i FT 642 i zaprezentowali prostą analizę produktów amplifikacji po przeprowadzeniu elektroforezy na żelu agarozowym. Garcia Del Blanco i wsp. (6) wskazali na możliwość genotypowania w obrębie chromosomu bakteryjnego F. tularensis, a tym samym różnicowania szczepów z wykorzystaniem elektroforezy pulsacyjnej i przy użyciu endonukleaz restrykcyjnych XhoI i BamHI, metody AFLP (ang. Amplified Fragment Lenght Polymorhism) umożliwiającej fingerprinting, a także sekwencjonowania genu 16S r RNA. Johansson i wsp. (12) wskazują na możliwość analizy sekwencji repetytywnych, takich jak mikrosatelity, oraz coraz szerzej stosowanych mikromacierzy DNA (ang. DNA microarray). Należy podkreślić, że zarówno zmienność międzyosobnicza wyrażająca się polimorfizmem, jak i obecność sekwencji konserwatywnych dla poszczególnych szczepów bakteryjnych dają olbrzymie możliwości diagnostyczne. Techniki biologii molekularnej są oparte o metody wysokiej czułości i powtarzalności wyników, co wiąże się ze specyfiką badanego materiału biologicznego, jakim są kwasy nukleinowe.

W rozpoznaniu różnicowym tularemii należy uwzględnić: gruźlicę, rodencjozę (gruźlica rzekoma), chorobę Tyzzera, listeriozę, toksoplazmozę oraz posocznice wywołane przez Pasteurella multocida, Escherichia coli, Salmonella sp.

Postępowanie i zwalczanie

Tularemia w Polsce należy do chorób podlegających obowiązkowi rejestracji z mocy ustawy z dnia 11 marca 2004 r. – Ustawa „O ochronie zdrowia zwierząt oraz zwalczaniu chorób zakaźnych zwierząt” (Załącznik nr 3). Zwalczanie tularemii polega na unieszkodliwieniu źródła zakażenia oraz przecięciu dróg rozprzestrzeniania się choroby. Działania te powinny być realizowane poprzez zwalczanie gryzoni polnych, przestrzeganie zasad higieny, unieszkodliwienie zwłok zwierząt, zabezpieczenie produktów spożywczych i wody przed dostępem gryzoni. Ponadto należy zachować szczególną ostrożność podczas skórowania królików czy zajęcy. Zwierzęta chore podlegają izolacji, wybiciu i utylizacji (palenie zwłok lub grzebanie – przed zakopaniem należy zanurzyć zwłoki w 3-5% lizolu w celu zlikwidowania ektopasożytów). Pomieszczenia podlegają dezynfekcji przy użyciu 0,1% formaliny, 1% trójkrezolu i 2-3% sody żrącej. Obowiązuje zakaz obrotu zwierzętami. Natomiast sztuki podejrzane o zakażenie podlegają szczepieniu interwencyjnemu przy użyciu preparatów zawierających żywe atenuowane pałeczki F. tularensis.

Tularemia jako zoonoza

W warunkach naturalnych ludzie narażeni są na zakażenie szczególnie przy ubijaniu zakażonych królików, ich skórowaniu oraz dzieleniu tuszki, bądź też na skutek ukąszeń spowodowanych przez bąki, komary i kleszcze. Choroba nie przenosi się z człowieka na człowieka. Wrota zakażenia stanowi skóra, spojówka, przewód pokarmowy oraz drogi oddechowe. Po okresie inkubacji trwającym od 1 do 21 dni (średnio 3-5 dni), co w dużym stopniu zależy od liczby bakterii wnikających do organizmu oraz zjadliwości szczepu zakażającego, rozwija się choroba. W zależności od miejsca wnikania zarazka do organizmu tularemia może przebiegać w kilku postaciach. Niezależnie od postaci klinicznej choroba rozpoczyna się nagle bólami głowy, dreszczami, wymiotami, gorączką (do 40°C) i osłabieniem. Ze względu na to, że z łatwością dochodzi do zakażeń, do wywołania procesu chorobowego potrzebne są niskie dawki zarazka, zakażenia mogą prowadzić do śmierci (7, 8). Istnieje konieczność opracowania bezpiecznej i efektywnej szczepionki przeciwko tularemii, która znalazłaby zastosowanie w ochronie ludzi na terenach jej endemicznego występowania oraz w przypadku użycia broni biologicznej (24). Królik stanowi odpowiedni model zwierzęcy do badań nad nowymi szczepionkami przeciwko tularemii.