lek. wet. Magdalena Cymerman

lek. wet. Maria Skrzeczyńska

Ocena rozmazu krwi obwodowej jest nieocenionym źródłem wiedzy o stanie pacjenta, czasem nawet wystarczającym do ustalenia rozpoznania. Choć badanie to jest czasochłonne i wymaga od badającego dużego doświadczenia, warto je wykonywać łącznie z analizą krwi na aparacie hematologicznym jako jeden z elementów badania morfologicznego krwi.

Rodzaje i zasada działania aparatów hematologicznych

Zasada działania najprostszych, a jednocześnie najpowszechniej używanych w lecznicach weterynaryjnych analizatorów hematologicznych opiera się na impedancji. W metodzie tej komórki krwi rozcieńczonej w roztworze elektrolitowym, przepływając przez otwór między dwiema elektrodami, zwiększają chwilowo opór, co prowadzi do powstawania impulsów elektrycznych. Ich wysokość jest proporcjonalna do objętości komórek, a liczba – do liczby komórek (12, 16). Krwinki przypisywane są do poszczególnych populacji na podstawie nasilenia generowanych przez siebie impulsów, a więc na podstawie objętości. Hematokryt obliczany jest w oparciu o liczbę erytrocytów (RBC) oraz średnią objętość erytrocytu (MCV). Leukocyty różnicowane są zazwyczaj na trzy populacje (tzw. analizatory 3-diff), rzadziej na cztery (4-diff) (tab. I). Nowsze analizatory różnicują też retikulocyty, erytroblasty (nRBC) oraz określają średnią objętość płytek krwi (MPV) (8, 10, 16).

Tabela I. Rozdział leukocytów metodą impedancji w analizatorze 3-diff (10)

Analizatory impedancyjne stanowią dobre narzędzie do przesiewowego badania morfologii krwi w przypadku zwierząt zdrowych oraz tych o znanej chorobie układu czerwonokrwinkowego. Ocena układu białokrwinkowego wymaga jednak dokładniejszej analizy (10).

Ze względu na różnicowanie komórek na podstawie ich wielkości, wyniki dotyczące płytek krwi zwykle obarczone są błędem, zwłaszcza w przypadku kotów, u których często występują płytki olbrzymie i zlepy płytek, wliczane przez analizator do populacji krwinek czerwonych i białych. Szacuje się, że z tego powodu jedynie 3% wyników wskazujących na małopłytkowość (< 200 G/l) u kotów jest wiarygodnych (12, 16).

Dokładniejsze analizatory, stosowane w laboratoriach analitycznych, oprócz lub zamiast impedancji wykorzystują m.in. metodę optyczną (pomiar światła rozproszonego przy przepływie komórek przez wiązkę światła laserowego), pomiar aktywności peroksydazy oraz ocenę właściwości jąder komórkowych, rodzaju ziarnistości cytoplazmatycznych, oporności błony komórkowej na lizę, zdolności do przechodzenia przez błonę pewnych barwników, możliwości selektywnego wiązania barwników i przeciwciał monoklonalnych oraz zdolności do przewodzenia prądu. Aparaty te różnicują krwinki białe na pięć lub nawet osiem populacji (5- i 8-diff) (8, 10, 12, 16).

Pomimo stosowania zaawansowanych technik pomiarowych, pewna część wyników wymaga weryfikacji mikroskopowej. Przyjmuje się, że im większa nieprawidłowość występuje w obrazie krwi, tym mniej dokładne wyniki uzyskuje się z analizatora (tab. II).

Tabela II. Wpływ różnych czynników na wartości uzyskiwane z analizatorów hematologicznych

Mikroskopowa ocena rozmazu, poza weryfikacją wyników analizatora hematologicznego, dostarcza też informacji na temat obecności ciałek wtrętowych i pasożytów krwi, które nie są rozpoznawane przez aparaty. 

Jak wykonać i oglądać rozmaz

Do badania hematologicznego wykorzystywana jest krew z antykoagulantem EDTA, który nie wpływa na morfologię komórek. Rozmaz krwi obwodowej należy wykonać możliwie jak najszybciej po pobraniu, aby zapobiec artefaktom wynikającym ze „starzenia się” krwi (np. dojrzewanie form pałeczkowatych granulocytów, obrzmienie erytrocytów). Zaleca się wykonanie kilku rozmazów z każdej próbki. Preparaty powinny być przechowywane w temperaturze pokojowej w pojemnikach ochronnych. W przypadku wątpliwości lub znacznych nieprawidłowości dodatkowe szkiełka mogą zostać wysłane do laboratorium w celu dalszej oceny.

Manualne obliczanie wzoru odsetkowego krwinek białych polega na wizualnej ocenie zabarwionego rozmazu krwi pod mikroskopem. Do prawidłowej oceny morfologii komórek niezbędne są świeże i dobrze przygotowane rozmazy. Wiarygodność wyniku uzależniona jest od jakości rozmazu, barwników, mikroskopu oraz umiejętności i doświadczenia osoby oceniającej.

Ręczny rozmaz krwi obwodowej wykonuje się, umieszczając kroplę krwi na brzegu odtłuszczonego szkiełka podstawowego. Drugie szkiełko (specjalne oszlifowane szkiełko do wykonywania rozmazów) umieszcza się przed kroplą pod kątem 30-45 stopni w stosunku do szkiełka podstawowego. Szkiełko do wykonywania rozmazów cofa się do kropli, która powinna się rozejść wzdłuż jego krawędzi. Następnie jednostajnym ruchem przesuwa się szkiełko do wykonywania rozmazów do końca szkiełka podstawowego, na którym umieszczono krew. Przy wykonywaniu tej czynności nie powinno się stosować silnego nacisku. Najlepiej, jeżeli krew pokryje 1/2-3/4 szkiełka podstawowego (ryc. 1). Dobrze zrobiony rozmaz jest gruby na początku (krwinki czerwone nakładają się na siebie), stopniowo staje się coraz cieńszy, a na końcu ma dobrze rozdzielone komórki. Wielkość kropli krwi, z której wykonywany jest rozmaz, kąt nachylenia szkiełka, szybkość i nacisk w trakcie rozprowadzania kropli – te wszystkie parametry mają wpływ na późniejszą jakość i ocenę. Nie jest możliwe podanie uniwersalnej „recepty” na wykonanie idealnego rozmazu. Czynność ta wymaga wprawy, którą można uzyskać tylko dzięki wielokrotnemu jej powtarzaniu (2, 14).

Ryc. 1. Wykonanie rozmazu krwi.

Rozmaz krwi powinien być dobrze wysuszony przed barwieniem, szkiełko powinno schnąć na powietrzu. Nie należy przyspieszać suszenia, np. suszarką, ponieważ komórki będą ulegały obkurczeniu, w wyniku czego w rozmazie mogą pojawiać się np. echinocyty jako artefakt. Z kolei niedostateczne wysuszenie może wpływać na pojawianie się w preparatach tzw. artefaktów wodnych.

W hematologii powszechnie stosowane jest barwienie Romanowskiego lub jego pochodne, takie jak Wright, Wright–Giemsa i May–Grunwald–Giemsa. Barwniki do szybkiego barwienia pozwalają zabarwić rozmaz w ciągu kilku sekund. Tak przygotowany preparat ma wystarczającą jakość diagnostyczną dla rutynowej oceny rozmazów w lecznicach weterynaryjnych (12).