Ryc. 1. Zbiornik na mleko (pozyskiwanie prób BTM).

Zbiorcza próba mleka ze zbiornika określana jest często angielskim skrótem BTM (bulk tank milk – nie należy mylić z polskim skrótem BTM, oznaczającym bezwodny tłuszcz mleczny). Jest to próba pobierana bezpośrednio ze zbiornika, w którym gromadzone jest mleko pochodzące z udoju krów (ryc. 1). Zbiorniki takie są wyposażone w odpowiednie urządzenia (agregat chłodzący, mieszadło) pozwalające na szybkie schładzanie mleka. Próby mleka ze zbiornika są pobierane rutynowo i dostarczają istotnych informacji na temat jakości samego mleka (PN-A-86002:1999 na mleko surowe do skupu). Mogą być także wykorzystywane do innych badań diagnostycznych pozwalających na ocenę stanu zdrowia stada.

Zaletą wykorzystania tych prób jest przede wszystkim wygoda i brak kosztów dodatkowych związanych z pobieraniem i przygotowaniem próby, jak ma to miejsce w przypadku próby pulowanej. Do większości analiz pobrane mleko nie może być mrożone, wymaga transportu do laboratorium w temperaturze chłodniczej (na lodzie lub w lodówce), a czas limitujący jego przydatność do badania to około 36 godzin. Wyjątkiem są próbki do badań w kierunku przeciwciał, które po samoistnym oddzieleniu się tłuszczu albo wirowaniu (przez mniej więcej 15 minut przy 2000 × g) jako mleko odtłuszczone można mrozić.

Krytycznym punktem przydatności prób zbiorczych mleka do dalszych badań jest właściwy sposób ich pobierania. Powinno się je pobierać 1-2 godziny po doju, przy czym wskazane jest, aby w zbiorniku znajdowało się mleko tylko z jednego udoju. Przed pobraniem próby mleko należy mieszać w zbiorniku przez mniej więcej 5 do 10 minut, po czym z wierzchniej warstwy pobiera się porcję o objętości około 60 ml. Tak pobrany materiał przenosi się do jałowych, zamykanych probówek. Nie należy nigdy pobierać prób, spuszczając mleko poprzez zawór.

Zbiorcze próby mleka wykorzystywane są przede wszystkim w badaniach zdrowotności wymienia i jakości mleka (Jayarao B.M., Wolfgang D.R., 2003). Niezależnie od obowiązujących badań wykonywanych zgodnie z polską normą dotyczącą mleka surowego przeznaczonego do skupu, wielu hodowców finansuje dodatkowo posiewy mikrobiologiczne wykonywane z prób BTM. Stanowią one element monitorowania zdrowia stada. Częstotliwość badania limitują w tym przypadku jedynie możliwości finansowe hodowcy, im częściej próby będą bowiem badane, tym więcej uzyskamy informacji na temat stanu zdrowia stada. Zazwyczaj pobiera się próby raz na tydzień, co dwa tygodnie, względnie raz na miesiąc. Interpretacja wyników uzyskanych przy jednorazowym tylko badaniu próby BTM powinna być jednak ostrożna. Znacznie lepszym materiałem do oceny sytuacji w stadzie są próby pobierane kilkakrotnie, np. w ciągu kilku kolejnych dni.

Brak jest obecnie wyznaczonych specjalnych standardów dotyczących mikrobiologicznych badań zbiorczych prób mleka. Laboratoria badawcze opracowują je w zasadzie samodzielnie. Najczęściej używane podłoża to agar (zwykły), agar tryptozowo-sojowy z dodatkiem krwi bydlęcej i eskuliny, agar Mac Conkeya oraz podłoże Chapmana lub pożywka wzrostowa dla paciorkowców. Na podłożach tych łącznie uzyskuje się wzrost bakterii tlenowych i beztlenowych, w tym pałeczek tlenowych, laktozododatnich i laktozoujemnych oraz niefermentujących, gronkowców i paciorkowców. Na płytkę w dwóch powtórzeniach nanosi się zwykle 0,1 ml próby, rozprowadzając ją. Tak przygotowane posiewy inkubuje się przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Uśredniając wynik uzyskany z dwóch powtórzeń, określa się CFU (jednostki tworzące kolonie) na mililitr (ml).

Dalsze badania prowadzi się, identyfikując bakterie najważniejsze w ocenie stanu zdrowia wymienia (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae). Ich izolacja z próby BTM potwierdza, że przynajmniej w jednej ćwiartce wymienia u jednej krowy, od której mleko trafiło do zbiornika, toczy się proces zapalny. Na podstawie liczby bakterii wyizolowanych z prób BTM nie można jednak szacować, ile ćwiartek wymienia w stadzie łącznie może być zainfekowanych. Interpretując wynik, należy zwracać również uwagę na rodzaj dominujących bakterii, gdyż o ile S. agalactiae „uczula” nas, by zwrócić baczniejszą uwagę na stany zapalne wymienia, o tyle masowe występowanie pałeczek może mieć związek z niewłaściwą higieną urządzeń udojowych i samego doju lub nieodpowiednim schładzaniem mleka. W interpretacji wyników badań prób BTM niezbędna jest zatem wiedza na temat środowiskowego występowania poszczególnych bakterii oraz możliwości powodowania przez nie kontaminacji.

Zbiorcze próby mleka są bardzo często wykorzystywane w epidemiologii weterynaryjnej. Mają one szczególne znaczenie w badaniach przeglądowych, których celem jest potwierdzenie braku jakiegoś zakażenia lub zarażenia w określonej populacji. Wyniki takich badań są zwykle podstawą utrzymania na danym terenie statusu „wolnego od choroby” i są bardzo często podstawą systemów monitorowania zdrowia populacji. W przypadku obecności zakażenia/ /zarażenia pozwalają natomiast na określenie podstawowych mierników epidemiologicznych (np. odsetka zakażonych stad na danym terenie). Ocena występowania zakażenia/zarażenia na podstawie badania prób BTM w powiecie, w którym znajduje się 100 stad krów mlecznych, będzie polegała na pobraniu (w sposób szybki i niewymagający wykwalifikowanego personelu), a następnie zbadaniu jedynie 100 prób. Jest to znacznie mniej pracochłonne niż zbadanie próby pulowanej z mleka zdojonego w tym celu od każdej krowy (a niekiedy nawet z każdej ćwiartki wymienia).

Tabela I. Minimalna liczba prób niezbędna do wykazania braku zakażenia/zarażenia w stadzie

Ryc. 2. Pobierając do badań zbiorcze próby mleka BTM, omija się tzw. inwazyjne procedury próbobrania, wykorzystywane mleko pochodzi bowiem z normalnego codziennego udoju stada.

Jeszcze bardziej kosztowne i pracochłonne są badania poszczególnych zwierząt. Decydując się na ten ostatni schemat badań, w każdym stadzie należy pobrać próbki od ściśle określonej liczby zwierząt. Liczba ta zależy od liczebności stada, ale również od natury samej choroby (szacowanej seroprewalencji) oraz od przyjętej dokładności badania (założone prawdopodobieństwo wykrycia choroby w stadzie – wybranego poziomu ufności) (tab. I). W przypadku stad liczących niewiele zwierząt oraz choroby, która szerzy się w stadzie powoli (przewidywana niska seroprewalencja), niezbędne jest zbadanie wszystkich zwierząt (tab. I). Wiąże się to oczywiście ze znacznie większymi kosztami w porównaniu z badaniem zbiorczych prób mleka. Zastosowanie BTM w diagnostyce laboratoryjnej jest natomiast warunkowane granicą wykrywalności (najmniejsze stężenie analizowanej substancji, które można wykryć daną metodą) stosowanego testu diagnostycznego i co się z tym wiąże – może prowadzić do niższej czułości badania w porównaniu z pozostałymi metodami.

Choroby zakaźne a BTM

W chorobach tła zakaźnego w próbach BTM zarówno bada się obecność antygenów (bezpośrednie wykazanie drobnoustrojów, np. testem ELISA wykrywającym antygen, lub użycie BTM do badań techniką PCR), jak i wykazywana jest obecność swoistych przeciwciał. Badania takie umożliwiają nie tylko wykrycie zakażenia/zarażenia na poziomie stada, ale również ocenę skali problemu w danym regionie bądź całym kraju. Wykazano, że wyniki badań zbiorczych prób mleka wykazują wysoką korelację z wynikami badań poszczególnych zwierząt w obrębie stada (Muskens i wsp., 2011).

W praktyce pobieranie i badanie BTM jest obecnie stosowane w przypadku wielu chorób zakaźnych i pasożytniczych.

Zakażenia Coxiella burnetii

W Polsce gorączka Q wywoływana przez Coxiella burnetii podlega aktualnie monitorowaniu na podstawie Rozporządzenia MRiRW z dnia 24 czerwca 2010 (DZ.U. 2010, nr 123), zmieniającego rozporządzenie w sprawie określenia jednostek chorobowych, sposobu prowadzenia kontroli oraz zakresu badań kontrolnych zakażeń zwierząt. W celu kontroli jej występowania corocznie bada się próbki krwi pobrane od bydła, owiec i kóz znajdujących się na obszarze powiatu, tak aby możliwe było wykrycie zwierząt serododatnich z 95% prawdopodobieństwem, przy założeniu, że odsetek zakażeń na obszarze tego powiatu wynosi 20%. Do przeprowadzenia badania mogą zostać użyte próbki krwi rutynowo pobierane w programach zwalczania brucelozy bydła, owiec i kóz. Są to badania o charakterze urzędowym.

W przypadku zakażenia Coxiella burnetii można wystandaryzować do badania prób BTM testy, jakie stosuje się do rutynowej oceny przeciwciał w surowicy (Muskens i wsp., 2011). Trafność tak przystosowanego testu do oceny poziomu swoistych przeciwciał w próbach BTM okazała się zadowalająca zarówno u owiec, jak i u bydła. Porównanie wyników badania obecności przeciwciał w próbach zbiorczych mleka owczego w stosunku do metod odwoławczych (PCR i test ELISA z próbkami surowicy) wykazało, że BTM mogą być z powodzeniem używane w badaniach epidemiologicznych (Ruiz-Fons F. i wsp., 2011). Porównywalne wyniki uzyskano także w badaniach przeprowadzonych u bydła mlecznego w Danii (Agger J. i wsp., 2010) i Wielkiej Brytanii (Paiba G.A. i wsp., 1998).

Zakażenia bydła herpeswirusami i pestiwirusami

Oceniano przydatność prób BTM w diagnostyce zakażeń wirusem BHV-1 u bydła. Test ELISA wykonywany ze zbiorczymi próbami mleka osiągnął czułość 76,5% i swoistość 97,2% (Raaperi K. i wsp., 2010).