Ocena mikroskopowa próbek pobranych z odbytnicy może dać odpowiedź na pytanie o przyczynę objawów żołądkowo-jelitowych występujących u pacjenta.

W przypadku pacjentów z objawami zaburzeń żołądkowo-jelitowych cytologia odbytnicy stanowi często uzupełnienie innych metod diagnostycznych służących do określenia przyczyn biegunki. Dzięki tej metodzie można również ustalić rozpoznanie. W czasie sesji American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) Forum, które odbyło się w 2023 roku w Filadelfii, w stanie Pensylwania, uczestnicy mieli okazję zapoznać się z cytologią odbytnicy. Omówiono takie zagadnienia jak pobieranie próbek, sposób dalszego postępowania z pozyskanym materiałem, a także obrazy mikroskopowe, jakie obserwuje się przy zastosowaniu tej metody, i ich znaczenie.¹

Francisco O. Conrado, DVM, MSc, DACVP, patolog kliniczny i adiunkt w Cummings School of Veterinary Medicine na Tufts University w North Grafton, Massachusetts, swoje wystąpienie prezentował w formie wirtualnej. „Temat ten może wydawać się zabawny, ale jest to bardzo tani i łatwy do wykonania test, który może pomóc ustalić rozpoznanie u pacjentów cierpiących z powodu chorób przewodu pokarmowego” – powiedział. – „Odnoszę wrażenie, że to temat, o którym zbyt mało się mówi, i chciałbym, aby lekarze klinicyści wykonywali to badanie znacznie częściej, ponieważ za pomocą tego testu można z pewnością uzyskać ciekawe informacje o znaczeniu diagnostycznym”.

Mimo że kał można badać za pomocą różnych testów diagnostycznych, o których dr Conrado krótko wspomniał w czasie swojego wykładu, jego prezentacja skupiała się na preparatach cytologicznych kału suszonych na powietrzu. Wyjaśnił, jak wykonać takie badanie, a także omówił obrazy mikroskopowe uzyskiwane dzięki tej metodzie, wskazując, które z nich uważa się za prawidłowe, a które za nieprawidłowe.¹

Pobieranie próbek

„W piśmiennictwie opisano kilka metod pobierania materiału przeznaczonego do cytologii odbytnicy lub badania cytologicznego kału” – powiedział dr Conrado. Metody te obejmują wykonanie preparatu z kału pobieranego bezpośrednio z odbytnicy za pomocą wymazówki, pozyskanie materiału poprzez płukanie odbytnicy solą fizjologiczną oraz pobranie zeskrobiny z błony śluzowej odbytnicy. Według dr. Conrado w zależności od zastosowanej metody pobierania próbek możliwości wykrywania istniejących nieprawidłowości są różne, ponieważ materiał jest pobierany z różnych części odbytnicy, które cechują się unikalnym składem komórkowym.¹

Wykonanie zeskrobiny polega na bezpośrednim delikatnym zeskrobaniu błony śluzowej odbytnicy. Metodę tę stosuje się zwykle do wykrywania głębokich zakażeń. Powszechnie stosowanymi narzędziami do pobierania próbek są aplikatory z bawełnianą końcówką nawilżoną roztworem fizjologicznym, tępo zakończona szpatułka lub końcówka palca zaopatrzona rękawiczką chirurgiczną. Dr Conrado zauważył także, że chociaż w czasie pobierania materiału nie powinno się stosować lubrykantów, do zapewnienia poślizgu można posłużyć się roztworem fizjologicznym.¹ „Jeżeli użyje się środka poślizgowego, pobrana próbka nie będzie nadawała się do badania cytologicznego” – powiedział. – „Do badań należy wykorzystywać świeżo pobrany materiał”.

Dr Conrado zauważył, że w idealnych warunkach od momentu pobrania materiału do rozpoczęcia badania nie powinno minąć więcej niż pięć minut. Zalecił wykonywanie rozmazów z kału jak najszybciej po pobraniu materiału, a także barwienie ich tak szybko, jak to możliwe.¹ „Chcecie mieć pewność, że wykonany rozmaz będzie cienki, złożony tylko z jednej warstwy komórek” – powiedział. – „Do oceny rozmazów używa się mikroskopów. Aby móc przyjrzeć się bakteriom, warto zastosować obiektywy imersyjne. W celu zabezpieczenia obiektywu przed zanieczyszczeniem kałem nakłada się szkiełko nakrywkowe”.

Dr Conrado zauważył, że w czasie barwienia kał może odkleić się od szkiełka mikroskopowego, a barwienie poprzez zanurzanie szkiełek mikroskopowych w barwniku może doprowadzić do zanieczyszczenia roztworów barwiących bakteriami zawartymi w próbce. Zasugerował, aby w przypadku gdy preparaty barwi się poprzez ich zanurzanie w roztworach barwiących, wymienić je po zakończeniu tej czynności. Zapobiegnie to zanieczyszczeniu kolejnych barwionych próbek, którymi mogą być rozmazy krwi lub materiał o innym pochodzeniu.¹

Ocena pobranego materiału

Według dr. Conrado materiał pobrany z odbytnicy i próbki kału ocenia się pod kątem typowej flory bakteryjnej, obecności nieprawidłowych komórek eukariotycznych i mikroorganizmów patogennych. „Jak mawiamy w gronie patologów klinicznych, nie obchodzi nas, w jaki sposób oceniasz próbkę, o ile wykonujesz to badanie mikroskopowe w sposób planowy” – powiedział dr Conrado. – „Rozpoczyna się od przeglądania preparatu pod małym powiększeniem, a kończy na dużym. Pamiętaj, aby nie pominąć kolejnych kroków analizy, pod obiektywami o pośrednich powiększeniach”.

Prawidłowy obraz mikroskopowy próbki

Według artykułu Anne Barger, DVM, MS, DACVP, profesora i kierownika Katedry Weterynaryjnej Medycyny Klinicznej na University of Illinois College of Veterinary Medicine w Urbanie, opublikowanego przez Illinois State Veterinary Medical Association, w rozmazie kału pobranego od zdrowego osobnika komórki jądrzaste nie powinny być obecne w ogóle lub mogą występować pojedynczo, natomiast powinna być obecna treść pokarmowa oraz „mieszana populacja bakterii” (ryc. 1). Ponadto w przypadku zeskrobiny błony śluzowej odbytnicy czasami widoczne są skupiska komórek nabłonkowych wyściełających odbytnicę, jak również mieszana populacja bakterii.²

Ryc. 1. Rozmaz kału pobranego od siedmioletniej sterylizowanej suki rasy golden retriever podczas wizyty kontrolnej odbywającej się z powodu infestacji nicieniami płucnymi. W rozmazie widoczna jest prawidłowa, niejednorodna flora bakteryjna, w której dominują bakterie o morfologii pałeczek. Widocznych jest także kilka wydłużonych komórek drożdży, których wygląd wskazuje, że należą do gatunku Cyniclomyces guttulatus (strzałka, szczegóły ich morfologii przedstawia wstawka w prawym górnym rogu zdjęcia). W lewym dolnym rogu zdjęcia widoczny jest element pochodzenia roślinnego. Barwienie metodą Wrighta–Giemsy, powiększenie 500×.

Dr Conrado stwierdził, że w materiale pobranym od zdrowych osobników bakterie z grupy ziarniaków są rzadkie, ale można w nim obserwować inną florę bakteryjną. Cyniclomyces guttulatus, gatunek drożdżaków powszechnie występujący u gryzoni i zajęczaków, w tym królików i kawii domowych, może być również obecny w próbkach kału pobranych od psów, m.in. w wyniku koprofagii. Ponadto w próbkach materiału pobranego z odbytnicy lub próbkach kału pochodzących od zdrowych osobników stwierdza się obecność elementów bezkomórkowych, takich jak treść pokarmowa i elementy roślinne oraz komórki, wśród których mogą występować komórki nabłonka płaskiego lub walcowatego pochodzącego z odbytnicy.¹

Nieprawidłowy obraz mikroskopowy próbki

W przypadku nieprawidłowego obrazu mikroskopowego materiału pobranego z odbytnicy lub próbki kału można zaobserwować cechy przerostu flory bakteryjnej albo występowanie innych mikroorganizmów (ryc. 2). Inne obserwowane nieprawidłowości mogą obejmować obecność licznych neutrofili w kale, co wskazuje na takie stany chorobowe jak bakteryjne zapalenie jelit, zapalenie dalszej części jelita grubego lub zapalenie odbytnicy, inwazja włosogłówki, choroba zapalna jelit oraz martwica tkanek w dalszej części jelit. Według dr. Conrado w kale można również zaobserwować obecność eozynofili, co sugeruje eozynofilowe zapalenie jelit lub eozynofilowe zapalenie jelita grubego, jak również reakcję zapalną powstałą w odpowiedzi na niektóre zakażenia, inwazje nicieni, obecność ciał obcych oraz nowotworów.¹

Ryc. 2. Zeskrobina błony śluzowej odbytnicy pobrana od rocznej sterylizowanej suki mieszańca, która trafiła na wizytę lekarsko-weterynaryjną z powodu przewlekłej biegunki. Kał zawiera ogromną liczbę drożdżaków i nadreprezentację bakterii o morfologii ziarniaków, co wskazuje na dysbiozę. Pies był poddany antybiotykoterapii i otrzymywał probiotyki, a wiadomo, że oba te rodzaje leków przyczyniają się do przerostu drożdżaków. Barwienie metodą Wrighta–Giemsy, powiększenie 1000×.

Na podstawie próbek kału można wykryć chorobę zapalną jelit.¹ „U zdrowych psów można czasami stwierdzić w badanym materiale obecność limfocytów, ale jeżeli występują one w nadmiarze i towarzyszą im liczne komórki plazmatyczne lub inne cechy świadczące o stymulacji antygenowej, to jest to typowy przykład nieprawidłowego obrazu mikroskopowego” – powiedział dr Conrado.