14/03/2018
Ryc. 4. Jajo Oxyuris equi.
Do znajdowania jaj Oxyuris equi w okolicy okołoodbytowej przydatne jest użycie przezroczystej taśmy klejącej. Za pomocą tej metody udaje się też niekiedy stwierdzić obecność wszy i innych pasożytów zewnętrznych. W celu pobrania próbki nakleja się na skórę odcinki taśmy długości 4 cm (z reguły dookoła odbytu i na okolicę krocza lub na skórę owłosioną), następnie odrywa się je i przykleja do szkiełka podstawowego, na które uprzednio nanosi się kroplę oleju mineralnego (pomaga to w usunięciu pęcherzyków powietrza i mylących artefaktów). Następnie ogląda się preparat przy niewielkim powiększeniu w poszukiwaniu charakterystycznych owalnych jaj Oxyuris equi, zaopatrzonych w wieczko (90 µm × 30 µm) (ryc. 4).
Użycie lampy Wooda u koni nie jest szczególnie przydatne, ponieważ tylko Microsporum sp. powoduje zielonożółtą fluorescencję w jej świetle na skutek produkcji metabolitów tryptofanu. W celu stwierdzenia dermatofitozy (liszaj obrączkowy) przydatne mogą być zeskrobiny skóry, skuteczniejsze i prostsze może być jednak wyrwanie włosów. Jeżeli próbki włosów mają być wysłane do badania na posiew, wskazana jest dezynfekcja zmian z użyciem alkoholu. Zdezynfekowany obszar należy dokładnie wysuszyć. Po wyschnięciu wyrywa się włosy za pomocą jałowych kleszczyków naczyniowych i przenosi je do jałowego, niegazoszczelnego pojemnika lub butelki. Grzyby patogenne kolonizują łodygę włosa, podczas gdy grzyby saprofityczne żyją na powierzchni skóry. Te ostatnie tworzą pleśń, która powoduje, że badanie mikologiczne staje się bezwartościowe. Z tego względu jałowe próbki włosów dają o wiele lepsze wyniki niż zeskrobiny skóry.
Ryc. 5. Włos zakażony dermatofitami, widoczne wyraźne konidia.
Badanie mikroskopowe można wykonać natychmiast – w obrazie widoczne są strzępki i konidia grzyba. Przydatne może być uprzednie rozpuszczenie keratyny za pomocą 10- lub 20-procentowego ługu potasowego (KOH), przy czym szkiełko podstawowe należy ostrożnie ogrzać przed badaniem przez 10-20 sekund lub pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. Wszystkie dermatofity koni występują zewnątrzwłosowo, a ich konidia są widoczne wzdłuż włosa (ryc. 5).
Ryc. 6. Hodowla Trichophyton equi po tygodniowej inkubacji (za zgodą Weterynaryjnego Centrum Diagnostyki Mikrobiologicznej Utrecht).
Ryc. 7. Ta zanieczyszczona próbka całkowicie przerosła pleśnią (za zgodą Weterynaryjnego Centrum Diagnostyki Mikrobiologicznej Utrecht).
Jeżeli w czasie badania mikroskopowego nie stwierdza się grzybów, konieczne jest wykonanie posiewu mikologicznego (ryc. 6). Także w tym przypadku niezbędne jest staranne pobranie próbek, ponieważ grzyby saprofityczne żyjące na powierzchni skóry powodują rozwój pleśni (ryc. 7), która sprawia, że posiew staje się bezwartościowy.
Dostępny komercyjny test (np. Fungassay®) zawiera podłoże Sabouraud z glukozą i czerwienią fenolową jako wskaźnikiem oraz antybiotyki zapobiegające wzrostowi bakterii. W przypadku stosowania tego podłoża, należy silnie docisnąć do niego próbkę, ale tak, by nie powodować zagłębienia jej w podłożu. Następnie próbkę umieszcza się w cieplarce w temperaturze 37°C (optimum dla Trichophyton sp.) na okres do 2 tygodni. Wczesnym objawem wzrostu grzybów jest czerwone zabarwienie podłoża po 24-36 godzinach (przesunięcie pH w kierunku zasadowym). Dermatofity tworzą białe puszyste kolonie (nigdy nie są one ciemne lub czarne). Śluzowate, ciemne lub bardzo jasne kultury to artefakty mogące powodować wyniki fałszywie dodatnie.
W specjalistycznych laboratoriach posiewy mikologiczne są wykonywane na podłoża wybiórcze, inkubowane w temperaturze 25°C, i podłoża Sabouraud B w temperaturze 30°C. Wynik jednoznaczny osiąga się zazwyczaj po 1-3 tygodniach. Jeżeli po 3 tygodniach stwierdza się brak wzrostu dermatofitów, wynik określany jest jako ujemny.
Wymazy stosowane są głównie w przypadku dermatofitozy, mogą być jednak użyteczne także przy leukocytoklastycznym zapaleniu naczyń/mieszków włosowych w obrębie pęciny i nadpęcia. W celu pobrania wymazu od oddzielonego strupa odcina się włosy i umieszcza strup stroną, która była skierowana do skóry, na kilku kroplach roztworu fizjologicznego soli. Następnie próbkę pozostawia się aż do jej spęcznienia. Roztwór soli fizjologicznej powinien stać się wyraźnie mleczny, a nadmiar gruzu komórkowego i grudki należy usunąć. Próbkę pozostawia się do wyschnięcia i utrwala nad płomieniem w temperaturze 50-60°C. Ostatecznie preparat barwi się metodą Grama, Giemzy lub Wrighta–Giemzy i bada mikroskopowo z użyciem imersji.
Należy wspomnieć, że możliwe jest także wykonanie preparatów odciskowych ze zmian sączących, które następnie barwi się błękitem metylenowym lub metodą Wrighta–Giemzy, oraz że próbki pobrane ze starych zmian są trudne do oceny i często stwierdza się w nich mieszaną florę bakteryjną oraz zdegenerowane komórki zapalne.
Technika umożliwiająca stwierdzenie zakażenia Dermatophilus spp.:
Ryc. 8. Urządzenia o różnej średnicy do wykonywania biopsji skóry.
Ryc. 9. Wykonanie biopsji na obwodowej części kończyny. Konia należy poddać sedacji, konieczne może być miejscowe znieczulenie.
W celu pobrania próbek do badania histopatologicznego konieczne jest wykonanie biopsji (ryc. 8 i 9), której wartości diagnostycznej nie należy jednak przeceniać. Wiele różnych zaburzeń chorobowych może powodować prawie identyczne zmiany histopatologiczne. Powoduje to, że patolodzy często nie mogą ustalić jednoznacznego rozpoznania. Nie jest rozsądne oczekiwanie, że patolog będzie w stanie pomóc w każdym przypadku. Największe szanse powodzenia istnieją, gdy histopatolog ma do dyspozycji dokładny wywiad, szczegółowy opis kliniczny oraz starannie wybrane wycinki skóry dotkniętej procesem chorobowym. Próbki skóry w warunkach prawidłowych są pobierane w celu ustalenia jednoznacznego rozpoznania, stwierdzenia określonych zmian klinicznych, monitorowania przebiegu choroby oraz potwierdzenia doszczętności usunięcia zmian nowotworowych.
